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技术资料/正文
分子蛋白丨酶联免疫吸附（ELISA）
566 人阅读发布时间：2024-01-23 17:31
酶联免疫吸附（ELISA）
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种常用的免疫反应定性和定量检测方法。它通过将可溶性的抗原或抗体结合到固相载体上（如聚苯乙烯），利用抗原抗体结合的专一性进行免疫反应。
通过ELISA，可以定位细胞内成分、评估抗酶抗体的合成效果、显示微量免疫沉淀反应结果，并且可以准确测量体液中特定抗原或抗体的浓度。
一、ELISA常规实验流程
（一）、双抗体夹心法（测抗原）
1、包被抗体：将特异性抗体球蛋白稀释至最适浓度（1～10 ug/ml）的包被缓冲液中，每个凹孔加入0.3 ml，然后在4℃过夜或37℃水浴中孵育3小时，最后存放在冰箱中。
2、洗涤：移除包被液，用含有0.05%吐温-20的洗涤缓冲液洗涤每个凹孔，洗涤3次，每次持续5分钟。
3、加入缓冲液：加入含有抗原的被检标本稀释缓冲液，每个凹孔加入0.2 ml，37℃下孵育1～2小时。
4、洗涤：移除包被液，用含有0.05%吐温-20的洗涤缓冲液洗涤每个凹孔，洗涤3次，每次持续5分钟。
5、加入酶标记特异性抗体溶液：加入稀释缓冲液中稀释的酶标记特异性抗体溶液，每个凹孔加入0.2 ml，37℃下孵育1～2小时，或根据预实验确定最佳作用时间。
6、洗涤：移除包被液，用含有0.05%吐温-20的洗涤缓冲液洗涤每个凹孔，洗涤3次，每次持续5分钟。
7、加入底物溶液：加入底物溶液（如OPD或OT）0.2 ml到每个凹孔中，在室温下作用30分钟（同时设立一个空白对照，加入0.4 ml底物和0.1 ml终止剂）。
8、加入终止剂：加入2M H2SO4或2M柠檬酸的终止剂0.05 ml到每个凹孔中。
9、观察并记录结果：可以目测或使用酶标比色计测定（对于OPD使用492nm波长）测量光密度（OD）值。
（二）、间接法（测抗体）
1、包被抗原：将抗原稀释至最适浓度（5～20 ug/ml）的包被缓冲液中，每个凹孔加入0.3 ml，然后在4℃过夜或37℃水浴中孵育2～3小时，最后存放在冰箱中。
2、洗涤：移除包被液，用含有0.05%吐温-20的洗涤缓冲液洗涤每个凹孔，洗涤3次，每次持续5分钟。
3、加入被检标本：每个凹孔加入0.2 ml用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清，37℃下作用1～2小时。
4、洗涤：移除包被液，用含有0.05%吐温-20的洗涤缓冲液洗涤每个凹孔，洗涤3次，每次持续5分钟。
5、加入酶结合物：每个凹孔加入0.2 ml稀释缓冲液稀释的酶结合物，37℃下作用1～2小时。
6、洗涤：移除包被液，用含有0.05%吐温-20的洗涤缓冲液洗涤每个凹孔，洗涤3次，每次持续5分钟。
7、加入底物溶液：在每个凹孔中加入0.2 ml底物溶液（如OPD或OT），在室温下作用30分钟（同时设置一个空白对照，加入0.4 ml底物和0.1 ml终止剂）。
8、加入终止剂：每个凹孔加入0.05 ml 2M H2SO4或2 M柠檬酸的终止剂。
9、观察并记录结果：可以目测或使用酶标比色计测定（对于OPD使用492nm波长）测量光密度（OD）值。
（三）、竞争法测抗原
1、包被抗体：将特异性抗体球蛋白稀释至最适浓度（1～10 ug/ml）的包被缓冲液中，每个凹孔加入0.3 ml，然后在4℃过夜或37℃水浴中孵育3小时，最后存放在冰箱中。
2、洗涤：移除包被液，用含有0.05%吐温-20的洗涤缓冲液洗涤每个凹孔，洗涤3次，每次持续5分钟。
3、分为两组：a组加入0.2 ml酶标记抗原和被检抗原混合液，b组只加入0.2 ml酶标记抗原液。在37℃下作用1～2小时。（混合液可以制备不同稀释度的样品）
4、洗涤：移除包被液，用含有0.05%吐温-20的洗涤缓冲液洗涤每个凹孔，洗涤3次，每次持续5分钟。
5、加入底物溶液：在每个凹孔中加入0.2 ml底物溶液（如OPD或OT），在室温下作用30分钟（同时设置一个空白对照，加入0.4 ml底物和0.1 ml终止剂）。
6、加入终止剂：每个凹孔加入0.05 ml 2M H2SO4或2 M柠檬酸的终止剂。
7、测定：使用酶标比色计测定a、b两组的光密度（OD）值，并计算出a、b、OD值的差值。
二、注意事项：
1、可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，进行酶标记测定的基本条件。常用的固相载体有聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。
2、包被抗原必须是可溶性、优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。制备包被抗原时需注意保持其免疫学活性。
3、对于某些抗原，需要进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，需采用梯度超速离心或亲和层析法进行提纯。
4、选择最适稀释度的抗原进行包被固相载体，可以经济且避免前带现象。可通过棋盘滴定法或单项滴定法确定最适包被浓度。
5、抗原包被固相载体时，时间、温度和pH值都会影响吸附效果。通常在4℃过夜包被可以使抗原吸附更完全均匀。对于聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，常在碱性条件下进行包被。抗原浓度一般为1-10 ug/ml，对于某些病原微生物抗原可适用5-20 ug/ml，但需通过滴定确定最适浓度。
参考文献：
[1]CFT、间接ELISA、竞争ELISA检测牛布氏杆菌病 [J] . 朱其太 . 畜牧兽医科技信息 . 1998,第009期
[2]荧光偏振免疫分析法与化学发光酶免疫法测定人血浆茶碱浓度的比较 [J] . 臧宁 ,岑美婷 ,张意钗 . 北方药学 . 2015,第008期
[3]荧光偏振免疫分析法与化学发光酶免疫法测定人血浆茶碱浓度 [J] . 杨秀斐 ,余玉木 ,徐克 . 医药导报 . 2006,第005期
[4]基于H6蛋白禽流感抗体间接ELISA检测方法建立与应用 [J] . 王微 ,张霞 ,张人俊 . 山地农业生物学报 . 2022,第1期