分子蛋白丨免疫印迹实验（WB）

1、准备SDS-PAGE试剂，具体配方见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2、准备匀浆缓冲液，将1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml、10%SDS 6.0 ml、β-巯基乙醇 0.2 ml、ddH2O 2.8 ml混合均匀。

3、准备转膜缓冲液，将甘氨酸 2.9 g、Tris 5.8 g、SDS 0.37 g、甲醇200 ml加ddH2O定容至1000 ml。

4、准备0.01 M PBS(pH7.4)，将NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、KH2PO4 0.24 g加ddH2O至1000 ml。

5、准备膜染色液，将考马斯亮兰 0.2 g、甲醇80 ml、乙酸2 ml、ddH2O118 ml混合均匀。准备包被液（5%脱脂奶粉，现配），将脱脂奶粉1.0 g溶于20 ml的0.01 M PBS中。

6、准备显色液，将DAB 6.0 mg、0.01 M PBS 10.0 ml、硫酸镍胺 0.1 ml、H202 1.0 ul混合均匀。

1、对于单层贴壁细胞总蛋白的提取： 

a. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液。 

b. 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3），轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作三次以洗去培养液。 

c. 按1 ml裂解液加10 ul PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。 

d. 每瓶细胞加400 ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。 

e. 裂解完后，用刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。 

f. 于4℃下12000 rpm离心5 min，将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。

2、对于组织中总蛋白的提取：

a. 将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中，用剪刀将组织块剪碎。 

b. 加400 uL单去污剂裂解液裂解组织，然后置于冰上。 

c. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，重复碾几次使组织尽量碾碎。 

d. 裂解30 min后，用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。

3、对于加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 

a. 将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。 

b. 弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤细胞，然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 

c. 用枪洗干上清后，加100 uL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min。 

d. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。

1、制作标准曲线： 

a. 从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。 

b. 取18个1.5 ml离心管，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。 

c. 按配方在各管中加入试剂。 

d. 混匀后，室温放置2 min。在生物分光光度计上比色分析。

2、检测样品蛋白含量： 

a. 取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min后即可用于测蛋白。 

b. 取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。 

c. 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次，再用无菌水洗一次。 

d. 取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

1、清洗玻璃板，使用洗衣粉轻轻擦洗玻璃板，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后晾干。

2、灌胶与上样： 

a. 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 

b. 灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。 

c. 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 

d. 准备4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，轻轻拔出梳子。 

e. 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

3、电泳，设置电泳时间为4～5 h，电压为40 V或60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

1、准备转膜所需的滤纸和硝酸纤维素膜，并将硝酸纤维素膜浸泡在水中2 h。

2、在转膜槽中放入转膜夹子、海绵垫、玻棒、滤纸和浸过的膜。

3、将玻璃板撬掉，将浓缩胶刮去，小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，再盖上滤纸和海绵垫，合起夹子。在转移液中进行操作，不断擀去气泡。

4、将夹子放入转移槽中，一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。

5、转完后将膜用1×丽春红染液染5 min，然后用水冲洗掉没染上的染液，晾干备用。

1、将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，在室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。

2、准备稀释适当浓度的一抗溶液，将膜放于抗体液面上，室温下孵育1～2 h后，在室温下用TBST洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。

3、准备稀释适当浓度的二抗溶液，将膜放于二抗液面上，室温下孵育1～2 h后，在室温下用TBST洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。

1、将A和B两种试剂混合，将膜与混合液接触1 min，然后将膜移至另一保鲜膜上去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

2、在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中。取出X-光片，放在膜上，关上X-光片夹，开始计时。根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min。曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，浸入显影液中显影，待出现明显条带后，终止显影。显影时间一般为1～2 min（20～25℃）。显影结束后，将X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，直到胶片透明为止。用自来水冲洗去残留的定影液后，室温下晾干。

1、将胶片进行扫描或拍照，使用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。