特殊染色丨番红-固绿染色

改良的番红O-固绿染色法的染色原理是利用嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合后呈现红色，而嗜酸性的骨组织与酸性染料固绿结合后呈现绿色或蓝色。通过与呈现红色的软骨形成对比，可以清晰区分软骨组织和骨组织。

番红O染色的深浅程度与阴离子浓度近似成正比关系，间接反映了基质中蛋白多糖的含量和分布情况。当软骨受损时，软骨中的糖蛋白会释放出来，导致基质成分的不均匀分布，从而导致番红O染色淡或不着色。通过使用图像分析软件，可以对番红O染色的软骨基质进行定量分析。而固绿与胶原纤维结合后，不易褪色。

1、脱蜡至水：使用二甲苯Ⅰ浸泡5分钟，二甲苯Ⅱ浸泡5分钟，二甲苯Ⅲ浸泡5分钟，然后使用无水乙醇浸泡1分钟，95%乙醇浸泡1分钟，75%乙醇浸泡1分钟，最后用蒸馏水冲洗5分钟。

2、铁苏木素染色：滴加铁苏木素染色液进行染色，染色时间为3-5分钟，然后用蒸馏水洗涤10-20秒，洗去多余的染色液。

3、分化：使用酸性分化液进行分化处理，分化时间为15秒。然后用流水冲洗5分钟。

4、固绿染色：滴加固绿染色液进行染色，染色时间为5分钟。

5、弱酸溶液洗涤：快速使用弱酸溶液洗涤切片10-15秒，以去除残留的固绿染料，然后晾干。

6、入番红染色液内浸染：将切片浸入番红染色液中染色，染色时间为5分钟。

7、脱水封固：依次使用95%乙醇（3秒）、无水乙醇（3秒）、无水乙醇（1分钟）、二甲苯（1分钟）、二甲苯（1分钟）、二甲苯（1分钟）进行脱水处理。最后使用光学树脂进行封固。

番红-固绿染色实例

1、番红在水中易褪色，因此在水洗的过程中应该迅速进行，以避免番红的褪色。确保将多余的染液洗去，但同时要注意不要让番红褪色。

2、染色后的切片应该呈现出清晰的形态结构，没有多余的固绿染液残留。确保染色过程中固绿染液的使用适量，避免过度染色导致切片结构不清晰。在洗涤过程中要彻底清洗，以确保没有固绿染液残留在切片上。

参考文献：

[1]番红、固绿混染剂应用于植物材料切片前整体染色——快速两色一步整染法 [J] . 容寿柏 . 河南科技学院学报：自然科学版 . 1979,第002期

[2]番红花红O-肝素钠体系的光谱分析及应用 [J] . 郭小群 ,马迪 . 四川理工学院学报（自然科学版） . 2007,第006期

[3]黄瓜幼苗茎段石蜡切片制作和番红染色实验方法改进 [J] . 康云艳 ,宋爱婷 ,柴喜荣 . 实验技术与管理 . 2022,第1期