组织/细胞凋亡丨Tunel染色

细胞凋亡中, 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧尿苷三磷酸核苷酸（dUTP）和荧光素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3'-OH 形成，很少能够被染色。由此，TUNEL 成为了检测 DNA 片段化（细胞凋亡）的最常用方法。

1、脱蜡和组织复性

将组织在二甲苯中浸泡两次，每次10-20分钟。在100%乙醇中洗涤两次，每次5分钟。然后依次在95%，70%和50%乙醇中洗涤3分钟。

2、PBS洗涤和蛋白酶处理

用200-500 µL PBS洗涤样品两次，每次5分钟。排除组织中多余的PBS，并在20 µg/mL蛋白酶K溶液中孵育15分钟。

3、TdT标记反应缓冲液/反应混合物孵育

配制TdT标记反应缓冲液。向每个样品中加入50 µL反应混合物，并在湿盒中避光下37℃孵育2小时。

4、PBS洗涤和DAPI复染

在PBS中将样品洗涤3次，每次5分钟。通过在1×DAPI中孵育10分钟对样品进行复染。

5、观察和拍照

将样品在PBS中洗涤3次，每次5分钟。然后加入水性封固剂或防淬灭溶液，封住盖玻片。最后使用荧光显微镜观察，并进行荧光显微镜拍照观察，红色通道（Ex/Em=555 nm/565 nm）。

Tunel染色实例

1、设立阳性和阴性细胞对照：

阳性组：用DNase酶处理，诱导细胞凋亡，使3'-OH末端暴露。每次实验只需做一个阳性组。

阴性组：不加TdT酶，其余操作和实验组相同。

实验组：除了阳性组和阴性组，所有样本均属于实验组。

2、选择固定液：

建议使用4%多聚甲醛（PBS）进行固定。不建议使用乙醇和甲醇作为固定液。不要选用含有甲醇的甲醛替代品，因为这会降低标记效率，使荧光观察困难。

3、贴壁细胞处理：

贴壁细胞在加药诱导凋亡后，细胞状态会发生改变，形态会皱缩边缘，贴壁粘附力降低。在对这些细胞进行实验染色时，需要小心操作，避免吹打造成细胞脱落。特别是在多次洗涤细胞时，操作要小心轻柔。

4、避光操作和孵育：

荧光基团长期暴露在普通光照下，会发生严重淬灭。

在实验操作中应尽量避光操作和孵育，以保证荧光观察效果。

参考文献：

[1]PELLETIER J, THOMAS G, VOLAREVIC S. Ribosome biogenesis in cancer: new players and therapeutic avenues[J]. Nat Rev Cancer, 2018, 18(1): 51-63. DOI:10.1038/nrc.2017.104 

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