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技术资料/正文
免疫荧光丨免疫荧光步骤及注意事项
1997 人阅读发布时间：2023-12-22 14:37
免疫荧光（IF）
免疫荧光（IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项检测技术。可用于检测和识别细胞和组织中蛋白质及其他分子的亚细胞分布和迁移。
相比传统的免疫组织化学（IHC）或免疫细胞化学（ICC）的显色标记方法，IF提供了一种替代方案。通过使用多种标记物的二级抗体，IF可以研究感兴趣蛋白质的共定位，这是传统IHC或ICC无法实现的。这种技术的一个优势是能够同时分析多个目标蛋白质，从而产生大量准确的亚细胞定位数据。
一、免疫荧光步骤：
1、细胞准备：
对于单层生长的细胞，将细胞接种到预先处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，用PBS洗涤两次。
对于悬浮生长的细胞，取对数生长的细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm, 5min）两次，然后用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定：
根据需要选择适当的固定剂来固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含有叠氮纳的PBS中，在4℃保存3个月。用PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟。
3、通透：
对于使用交联剂（如多聚甲醛）固定的细胞，一般需要在加入抗体之前进行通透处理，以确保抗体能够到达抗原部位。选择通透剂时应充分考虑抗原蛋白的性质。通透时间一般在5-15分钟。通透后用PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟。
4、封闭：
使用封闭液对细胞进行封闭处理，时间一般为30分钟。
5、一抗结合：
在室温孵育1小时或者在4℃过夜。用PBST洗涤3次，每次冲洗5分钟。
6、二抗结合：
对于间接免疫荧光，需要使用二抗。在室温避光孵育1小时。用PBST洗涤3次，每次冲洗5分钟，然后再用蒸馏水洗涤一次。
7、封片及检测：
滴加一滴封片剂，然后封片，最后使用荧光显微镜进行检查。
免疫荧光实例
二、注意事项：
1、设置对照：可以使用阳性和阴性对照来确定结果的准确性，并帮助确定任何问题的来源。
2、样品和试剂的存储：由于IF中所用抗体和实验样品的荧光性质，因此必须适当存储。最好将荧光抗体和经过IF处理的样品都保存在完全黑暗的环境中。使用琥珀色或铝箔覆盖抗体管。
3、使用适当的固定剂：醛可用于标记膜结合抗原或细胞骨架抗原，并应用于核蛋白或线粒体蛋白。醛固定后的样本需要抗原修复和打孔渗透步骤才能正确检测抗原。如果使用单克隆抗体推荐有机溶剂用于组织固定。甲醇适用于冷冻样本的固定；丙酮固定对组织学保存效果较好。
4、仔细选择抗体：应检查所有抗体，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，以确保与目标抗原具有高的亲和力。所用的二抗必须与一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗检测小鼠来源的一抗。
免疫荧光实例
5、多色染色：最好使用在不同物种中产生的一抗。如果使用间接检测，请使用已预先吸附在检测其他蛋白质的一抗和二抗的种属以及实验样品的物种中的二抗。这样可以最大程度地减少跨物种的反应性和非特异性结合。所有二抗也应在同一物种中产生，以最大程度地减少交叉反应。
一旦确定抗体特异性，就可以同时或依次将目标抗原与其抗体孵育，顺序孵育往往会产生更好的结果。对于亚细胞靶标的共定位或复染色，请选择对细胞器标记特异的抗体。
6、决定直接或间接染色：两种方法都有优点和缺点，根据实验需求选择。使用这两种方法，都应该确保充足的洗涤以最小化非特异性的结合。
7、选择没有光谱重叠的荧光团：IF是一种很好的多路复用分析技术，测量如此多的参数，那么使用能够提供可分辨信号的荧光团是很有必要的。
参考文献：
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