检测实验丨革兰氏染色实验

革兰氏染色

革兰氏染色（Gram Staining），又称革兰染色法，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。该方法由丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram）于1884年创立，最初用于鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系，后逐渐推广为鉴别细菌种类的重要方法。

革兰氏染色法通过特定的染色步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，对由细菌感染引起的疾病的临床诊断及治疗具有广泛用途。

革兰氏染色的原理主要基于细菌细胞壁结构的差异。细菌细胞壁主要由肽聚糖层构成，但革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构存在显著差异：

革兰氏阳性菌：细胞壁较厚（20-80nm），肽聚糖层多达50层，且交联致密。此外，部分革兰氏阳性菌还含有磷壁酸，这些成分使得细菌在染色过程中能牢固地保留结晶紫与碘的复合物，不易被脱色剂洗脱，因此染色后呈紫色。

革兰氏阴性菌：细胞壁较薄（15-20nm），且外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄且交联度差。在染色过程中，类脂为主的外膜容易溶解，使得结晶紫与碘的复合物无法被牢固保留，容易被脱色剂洗脱。随后，经过红色染料复染，革兰氏阴性菌呈现红色。

实验试剂：

无水乙醇、二甲苯、革兰氏染色试剂盒、中性树胶

实验仪器：

LEiCA TP-1020脱水机、LEiCA HistoCore MULTICUT病理切片机、包埋机、冻台、组织摊片机、烤箱、载玻片、盖玻片、OLYMPUS CKX43-LP显微镜、3DHISTECHP250FLASH全景扫描仪

1、石蜡切片脱蜡至水：

依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min--无水乙醇Ⅰ3min-无水乙醇Ⅱ3min-90%酒精3min-80%酒精3min--70%酒精3min蒸馏水洗。

2、胭脂红染色：

胭脂红染色液滴染5min,倾去染液。

3、分化：

酸性乙醇分化液分化2-5秒，而后流水冲洗3-5秒。

4、草酸铵结晶紫染色：

草酸铵结晶紫染色液滴染5min,倾去染液，用滤纸吸干组织周围剩余染液。

6、Weigert碘液处理：

weigert碘液处理1分钟，倾去碘液，用滤纸反复吸干切片内的水分。

7、分化：

用苯胺二甲苯分化至切片无紫色脱出，立即用二甲苯洗涤。

8、洗涤封片：

滴入新的二甲苯反复洗涤多次，彻底把苯胺洗去，中性树胶封片。

※实验结果示例：

革兰氏阳性细菌------蓝紫色

革兰氏阴性细菌-----粉红色

细胞核------红色

革兰氏染色