实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，简称qPCR）是一种高灵敏度的核酸定量技术，它结合了PCR扩增技术与荧光标记技术，能够在PCR扩增过程中实时监测DNA的扩增情况，并据此对目标DNA或RNA进行定量分析。该技术广泛应用于基因表达研究、疾病诊断、病原体检测等领域。

实时荧光定量PCR的原理是在PCR反应体系中加入荧光染料（如SYBR Green）或荧光探针（如TaqMan探针）。这些荧光物质可以与DNA双链结合，并在PCR扩增过程中随着DNA的增加而发出荧光信号。通过实时监测荧光信号的变化，可以反映DNA的扩增情况。荧光信号的强度与PCR产物的量成正比，从而可以通过荧光信号强度来推算出目标DNA或RNA的起始浓度。

实验试剂：

RNA酶抑制剂、TRIzol或其他RNA提取试剂、氯仿、异丙醇、乙醇、PCR酶、dNTPs、PCR缓冲液、特异性引物、荧光染料或探针、去离子水或RNA/DNA酶-free水等。

实验仪器：

离心管、移液器及吸头、离心机、PCR仪、PCR反应管或反应板、热盖或热封膜、涡旋混合器移液工作站、紫外分光光度计等。

1、实验准备：

①收集待检测的DNA或RNA样品，确保样品的质量和数量满足实验要求。

②根据目标序列设计特异性引物，引物应具有合适的长度、GC含量和退火温度。

③准备PCR反应所需的各种试剂，包括PCR酶、dNTPs、缓冲液、荧光染料或探针等。

2、PCR反应体系配制：

①将设计好的引物进行适当稀释。

②将荧光染料或探针加入PCR反应体系中。

③加入准备好的样品、PCR酶、dNTPs和缓冲液等试剂，完成PCR反应体系的配制。

3、PCR反应：

将配制好的PCR反应液分装到PCR反应管或反应板中。设置PCR仪的反应程序，包括预变性、变性、退火、延伸等步骤的温度和时间。

在PCR反应过程中，通过PCR仪的实时荧光检测系统监测荧光信号的变化，并记录每个循环的荧光信号值。

4、数据分析：

绘制荧光信号曲线图，观察荧光信号的变化趋势。

设定合适的阈值，计算每个反应孔达到阈值时的循环数（Ct值）。通过比较不同样品之间的Ct值，实现对目标DNA或RNA的定量分析。

※实验结果示例：

QPCR-产物溶解曲线图

QPCR-实时扩增曲线图