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技术资料/正文
免疫组化（IHC）操作步骤
763 人阅读发布时间：2024-07-04 16:41
免疫组化（IHC）
免疫组化(immunohistochemistry)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记了抗体的显色剂显色，从而确定组织细胞内的抗原，对抗原进行定位、定性以及定量的研究。
免疫组化不仅提高了病理诊断的准确性，还在恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断、确定转移性肿瘤的原发部位、对肿瘤进行进一步的病理分型以及发现微小的转移灶等方面发挥着重要作用。
一、染色原理：
免疫组化染色的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性结合）的物质。
抗体则是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
在免疫组化染色过程中，首先需要将特定的抗体与显色剂（如荧光素、酶等）结合，形成标记抗体。然后，将标记抗体与组织切片中的抗原进行特异性结合。结合后，通过化学反应使显色剂显色，从而在显微镜下观察到抗原的存在及其分布位置。
二、材料与仪器：
实验试剂：
无水乙醇、二甲苯、二步法免疫组化检测试剂盒、免疫组化抗原修复缓冲液、苏木素染色液、中性树胶
实验仪器：
LEiCA TP-1020脱水机、LEiCA HistoCore MULTICUT病理切片机、包埋机、冻台、组织摊片机、烤箱、载玻片、盖玻片、OLYMPUS CKX43-LP显微镜、3DHISTECHP250FLASH全景扫描仪
三、实验步骤：
1、 石蜡切片脱蜡至水：
依次将石蜡切片放入
❶二甲苯Ⅰ20min❷二甲苯Ⅱ20min
❸无水乙醇Ⅰ3min❹无水乙醇Ⅱ3min
❺90%乙醇3min❻80%乙醇3min
❼70%乙醇3min❽蒸馏水洗
2、 抗原修复：
组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的高压锅内进行抗原修复，高压锅压力上升至开始冒气时计时3min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中晃动洗涤浸泡3次，每次3min。
3、 阻断内源性过氧化物酶：
切片放入内源性过氧化物酶阻断剂中，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS（PH7.4）中晃动洗涤浸泡3次，每次3min。
4、孵育一抗：
轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
5、滴加反应增强液：
切片置于PBS（PH7.4）中晃动洗涤浸泡3次，每次3min。切片稍甩干后在圈内滴加反应增强液覆盖组织，37℃孵育20min。
6、滴加增强酶标聚合物:
切片置于PBS（PH7.4）中晃动洗涤浸泡3次，每次3min。切片稍甩干后在圈内滴加增强酶标聚合物覆盖组织，37℃孵育20min。
7、DAB显色：
切片置于PBS（PH7.4）中晃动洗涤浸泡3次，每次3min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
8、复染细胞核：
苏木素复染5s左右，自来水漂洗。
9、脱水透明封片：
将切片依次放入
❶70%乙醇3min❷80%乙醇3min
❸90%乙醇3min❹无水乙醇Ⅰ3min
❺无水乙醇Ⅱ3min ❻二甲苯Ⅰ5min
脱水透明，中性树胶封片。
※实验结果示例：
正常情况下，苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。
四、注意事项
1、组织脱水
组织脱水要彻底，不然会出现组织掉片的现象，而且显色效果差，容易混淆诊断。
2、抗原修复
热修复包括水煮加热、高压加热和微波加热3种。最常用的抗原修复方法是热压修复。
3、抗体的选择和使用
选用与使用的一抗同源性的二抗。要选择适宜的一抗，不同的二抗与一抗浓度不匹配，都不能得到满意的结果。
4、显色反应
DAB显色剂须现配现用，切片多时应分次配制，分批显色。根据温度和整体显色情况决定终止反应，一般显色时间3～5min，时间过长致显色过深和背景着色，过短致反应不足或出现假阴性。
5、试剂的保存
因为抗体是蛋白质，保存或使用不当不但会造成浪费，而且变质会出现假阴性结果。
要注意抗体的有效期，对于一次用不完的抗体可保存在冰箱内，而不要放在冷冻室，反复冻融，抗体效价会急剧下降而失效。
同时防止抗体的相互交叉污染和细菌污染。