免疫共沉淀检测（CO-IP）

免疫共沉淀检测（CO-IP）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是一种经典的用于研究蛋白质相互作用的实验方法。它以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，通过特异性抗体捕获靶蛋白及其相互作用蛋白，从而鉴定和分析这些蛋白质在细胞内的相互作用。

实验试剂：

1.5M Tris-HCl pH 8.8缓冲液、1M Tris-HCl pH 6.8缓冲液、30%的丙烯酰胺制胶液（29：1）、RIPA裂解液、TEMED、BSA、过硫酸铵、TWEEN 20、甘氨酸、Tris、氯化钠、甲醇、5X蛋白质上样缓冲液、Marker、实验所需抗体

实验仪器：

纯水仪、紫外分光光度计、高速低温组织研磨仪、电泳仪、电泳槽、转膜槽、凝胶玻璃板、固定夹、万分位天平、全自动化学/荧光/凝胶成像分析系统、制冰机、低温高速离心机、摇床

一、蛋白样品提取

1、细胞裂解

使用高速低温组织研磨仪，按25T细胞培养瓶5瓶细胞量加入1毫升裂解液（含PMSF）。研磨完毕后，将匀浆液转移至1.5ml离心管，冰上裂解30分钟。

2、离心与浓度调整

4℃离心，吸取上清液，测定蛋白浓度。取出50μL作为Input组，剩余上清液调整浓度至2μg/μL。吸出500μL调好浓度的上清备用。

3、预清除

每管加入5μL Protein A和Protein G，4℃旋转混匀1小时。4℃ 12000g离心1分钟，吸取上清至新管。

4、抗体结合

加入3μL HO-1抗体（IgG组加入3μL兔IgG）。4℃旋转混匀过夜。

5、免疫沉淀

第二天上午，每管加入5μL Protein A和Protein G，4℃旋转混匀3小时。4℃ 12000g离心1分钟，弃上清。用500μL 1×wash buffer清洗沉淀3次，每次清洗后4℃ 12000g离心1分钟，弃上清。

6、样品制备

用40μL 1×SDS loading buffer重悬沉淀，涡旋振荡后微离心。煮样本5分钟，4℃ 14000g离心1分钟，取上清作为最终的沉淀组上样溶液。

二、SDS-PAGE电泳

1、凝胶制备

制备10%分离胶和4%浓缩胶。灌制分离胶，用95%酒精覆盖，室温凝固约40分钟。倒掉酒精，加入浓缩胶，插入梳子，室温凝固约40分钟。

2、电泳

取出蛋白样品，与5×上样缓冲液混合，95℃变性10分钟。将样品加入凝胶孔，80V稳压电泳至染料到达适当位置。

三、凝胶转膜

1、PVDF膜预处理

甲醇浸泡2-3分钟，水、电转液依次漂洗。

2、转膜

剪裁滤纸，浸泡于转膜缓冲液。取出凝胶，按“海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵”顺序装入转膜夹，排除气泡。放入转膜槽，250mA转膜60-90分钟。

四、抗体孵育及检测

1、一抗反应：

将一抗用封闭液稀释制成一抗工作液；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃缓慢摇动反应过夜。

2、洗膜：

将反应膜放入平皿中，用1×TBST 洗涤三次，（室温下快速摇动洗涤）每次10 分钟，洗净未结合的一抗。 

3、二抗反应：

将二抗用封闭液稀释制成二抗工作液；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液, 室温缓慢摇动作用60分钟。

4、洗膜：

将反应膜放入平皿中，用1×TBST 洗涤三次，（室温下快速摇动洗涤）每次10 分钟，洗去游离二抗。

5、检测：

曝光及洗片后，用image J软件分析灰度值。

1、特异性：确保使用的抗体具有高度特异性，以减少非特异性结合带来的假阳性结果。

2、低温环境：整个实验过程需要在低温下进行，以保持蛋白质的天然构象和相互作用。