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技术资料/正文
检测实验丨流式表面抗原鉴定实验步骤及注意事项
1387 人阅读发布时间：2024-07-16 15:36
流式表面抗原鉴定
流式细胞术（Flow Cytometry，简称FCM）借助流式细胞仪，能够详尽地检测并筛选单个微粒的多元属性。
该技术以其快速性、精确性和客观性著称，涵盖了从样品液流技术的精密控制，到细胞精确计数与高效分选的整个过程，再到计算机对数据的深度采集与智能分析，构建了一个全面的细胞分析平台。
一、检测原理：
FCM通过精密设计的液流技术，确保样本中的微粒以单列、高速且稳定的状态流经检测区域。在这一过程中，细胞或颗粒被逐一曝光于激光束下，其散射光与荧光特性被精确捕捉，这些特性往往反映了细胞的形态、内部结构、表面分子表达及功能状态等关键信息。
借助先进的细胞计数与分选技术，FCM能够实时、准确地统计细胞数量，并根据预设的参数标准，如荧光强度、细胞大小、复杂度等，对目标细胞群体进行精准识别与分离。这一过程不仅提高了实验效率，还确保了分选结果的纯度和回收率。
FCM配备的计算机数据处理与分析系统，能够自动收集、整合并深度分析检测过程中产生的大量数据，通过复杂算法处理，提取出有价值的信息，如细胞亚群分布、信号强度变化等，为科研人员提供直观、全面的实验结果。
二、材料与仪器：
实验试剂：
待检测样本、流式直标抗体、PBS、流式 stain buffer、EP 管、固定剂、红细胞裂解液（血液样本选用）
实验仪器：
NOVOCYTE2000流式细胞分析仪、离心机、冰箱、移液器、涡旋振荡器、显微镜
三、实验步骤：
一、细胞样本
1、细胞准备：
倒掉细胞培养液，用适量PBS洗涤细胞。用胰酶消化或枪吹打使细胞脱落，1000 rpm离心15分钟。弃上清，用1 ml流式stain buffer重悬细胞，转移至标好标签的EP管中。
2、离心与重悬：
300 g，4℃离心5分钟，弃上清。用100 μL stain buffer重悬细胞。
3、抗体孵育：
加入适量体积的细胞表面标记物偶联抗体或同型对照。4℃避光孵育30分钟以上。
4、清洗与破膜（如需）：
加入1 ml stain buffer清洗细胞，300 g，4℃离心5分钟，弃上清。如需破膜，则加入100 μl固定剂，室温避光孵育15分钟。用1 ml stain buffer洗涤一次，300 g，4℃离心5分钟，弃上清。加入100 μl破膜剂和适量体积的胞内抗体或同型对照，4℃避光孵育20~30分钟。再次用1 ml stain buffer清洗细胞，离心弃上清。
5、分析或保存：
用200 μL stain buffer重悬细胞，及时上机分析。
或用200 μL 4%甲醛固定，2~8℃避光保存，并在24小时内分析。
二、组织样本
1、组织处理：
取适量新鲜组织于EP管中，加入1 ml PBS。剪碎组织，用匀浆机匀至单细胞悬液，过滤器去除残渣。
2、离心与重悬：
300 g，4℃离心5分钟，弃上清。用100 μL stain buffer重悬细胞。
3、抗体孵育：
加入适量体积的细胞表面标记物偶联抗体或同型对照。4℃避光孵育20~30分钟。后续步骤（同细胞流式中的4和5步骤）。
三、全血样本
1、抗体孵育：
取100 μl肝素抗凝的人外周血，加入适量流式抗体，混匀。4℃避光孵育20~30分钟。
2、红细胞裂解：
加入1.5×红细胞裂解液2 ml，混匀，室温避光孵育10~15分钟至液体澄清透明。
3、离心与清洗：
1000 rpm离心5分钟，弃上清。加入1 ml stain buffer混匀，300 g，4℃离心5分钟，弃上清。
4、分析或保存：
用200 μL stain buffer重悬细胞，及时上机分析。或用200 μL 4%甲醛固定，2~8℃避光保存，并在24小时内分析。
※实验结果示例：
细胞及组织抗体多标染色实例
四、注意事项
1、流式细胞术一般用于活细胞检测，通常需要当天完成上机前的所有实验，如果当天来不及处理，可以用多聚甲醛固定液固定，然后放置 4° 冰箱隔天进行上机检测。
2、流式上机前一般需要制备单染管，尤其是进行多重标记，可以进行荧光补偿调节。